Основная концепция
Конфокальный принцип точка датчика из патента Минсков
Принцип конфокальной микроскопии был запатентован в 1957 году Марвин Мински и стремится преодолеть некоторые ограничения традиционных широкоугольных микроскопов флуоресценции . В обычном (т.е. широкого поля) флуоресцентный микроскоп , весь образец затопляются равномерно свет от источника света. Все части образца в оптическом пути возбуждаются в то же время и в результате флуоресценции детектируют с помощью микроскопа фотодетектора или камер , включая большую несфокусированный фон часть. В противоположность этому, конфокальный микроскоп использует точку подсветки (см функция рассеяния точки) и крошечное отверстие в оптически сопряженной плоскости в передней части детектора, чтобы исключить из фокуса сигнала - название «конфокальной» происходит от этой конфигурации. Как только свет, излучаемый с помощью флуоресценции очень близко к фокальной плоскости можно обнаружить, изображение в оптическом разрешении , в частности, в направлении глубины образца, гораздо лучше, чем у широкого поле микроскопов. Тем не менее, так как большая часть света от образца флуоресценции блокируется на прокол, это повышенное разрешение за счет уменьшенной интенсивности сигнала - так долго воздействия часто требуются. Чтобы компенсировать это падение сигнала после того, как прокол , интенсивность света обнаруживается с помощью чувствительного детектора, как правило, фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) или лавинным фотодиодом , превращая светового сигнала в электрический, который записывается с помощью компьютера.
Как только одна точка в образце освещена в то время, 2D или 3D изображений требуется сканирование над регулярной растра (т.е., прямоугольный шаблон параллельных линий сканирования) в образце. Луч сканируют поперек образца в горизонтальной плоскости с помощью одного или более (серво контролируется) осциллирующие зеркала. Этот метод сканирования, как правило, имеет низкую реакционную задержку и скорость сканирования может изменяться. Медленное сканирование обеспечивают лучшее отношение сигнал-шум , что приводит к лучшей контрастности и более высоким разрешением.
Достижима толщина фокальной плоскости определяется главным образом от длины волны используемого света, деленной на числовой апертуры этого объектива , но и оптических свойств образца. Тонкие оптические секционирования возможно делают эти типы микроскопов особенно хороши в 3D визуализации и профилировании поверхности образцов.
Последовательные срезы составляют «Z-стек», который может быть либо обработан определенным программным обеспечением для создания 3D-изображения, или он объединяется в 2D стеку (преимущественно максимальная интенсивность пикселя берутся, другие общие методы включают использование стандартного отклонения или суммирования пикселей).
Конфокальная микроскопия обеспечивает емкость для прямого, неинвазивного, серийного оптического секционирования интактных, толстых и живых особей с минимумом подготовки проб, а также незначительным улучшением в боковом разрешении. Биологические образцы часто обрабатывает флуоресцентные красители , чтобы сделать выбранные объекты видимыми. Однако, фактическая концентрация красителя может быть низкой, чтобы свести к минимуму нарушения биологических систем: некоторые инструменты могут отслеживать отдельные молекулы флуоресцентных. Кроме того, трансгенные методы могут создавать организмы, которые производят свои собственные флуоресцентные молекулы химерных (такие как сплав GFP, зеленого флуоресцентного белка с представляющим интерес белком). Конфокальные микроскопы работают по принципу точечного возбуждения в образце (дифракции ограничено точечные) и обнаружение точки результирующего сигнала флуоресцентного. Обскуры на детекторе обеспечивает физический барьер, который блокирует вне фокуса флуоресценции. Только в фокусе, или центрального пятна диска Эйри, записывается. Растровое сканирование образца в одной точке, в то время допускает тонкие оптические участки должны быть собраны путем простого изменения Z-фокус. Полученные изображения могут быть сложены, чтобы произвести 3D - изображение образца.
Методы, используемые для горизонтального сканирования
Четыре типа конфокальных микроскопов являются коммерчески доступным:
Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы использовать несколько зеркала (обычно 2 или 3 сканирований линейно вдоль осей х и у-ось) для сканирования лазера на образец и «descan» изображения через фиксированную обскуру и детектор.
Пользы
CLSM широко используется во многих биологических научных дисциплин, от клеточной биологии и генетики в области микробиологии и биологии развития . Он также используется в квантовой оптики и нано-кристаллической визуализации и спектроскопии.
Биологии и медицины
Пример стопки конфокальной микроскопии изображений, показывающих распределение актиновых филаментов по всей клетке.
Клинический, КЛСМ используется при оценке различных глазных заболеваний, и особенно полезно для получения изображений, качественного анализа и количественной оценки эндотелиальных клеток в роговице . Он используется для локализации и идентификации присутствия нитевидных элементов грибов в роговичной стромы в случаях keratomycosis , что позволяет быстро поставить диагноз и тем самым раннее учреждение окончательной терапии. Исследование методов CLSM для эндоскопических процедур (эндомикроскопия) также показывает обещание. В фармацевтической промышленности, было рекомендовано, чтобы следить за процессом изготовления тонких фармацевтических форм пленки, чтобы контролировать качество и однородность распределения лекарственного средства.
Оптика и кристаллография
CLSM используется в качестве механизма поиска данных в некоторых оптическом хранении данных 3D - системах и помог определить возраст папируса Магдалины .
Варианты и усовершенствование
Улучшение осевого разрешения
Точка распространение функция точечного эллипсоид, несколько раз до тех пор, как это широко. Это ограничивает осевое разрешение микроскопа. Один из методов преодоления этого 4 π микроскопии , где падающий и излучаемый свет или могут мешать как сверху, так и снизу образца, чтобы уменьшить объем эллипсоида. Альтернативная методика конфокальной микроскопии тета . В этой технике конус осветительного света и детектируемый свет расположен под углом друг к другу (наилучшим результатам, когда они перпендикулярны). Пересечение двух форы функций дает гораздо меньший эффективный объем образца. Из этого эволюционировали одного самолета подсветки микроскопа . Дополнительно деконволюции могут быть использованы с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки , чтобы удалить из фокуса света, улучшая контраст в обеих осевых и боковых плоскостях.
Супер разрешение
Есть конфокальной варианты, которые достигают разрешения ниже дифракционного предела, такие как стимулированной эмиссии обедненной микроскопии (STED). Кроме этой техники широкое разнообразие других методов (не конфокальной основе) супер-разрешением доступны как пальмовое, (д) ШТОРМОВАЯ, SIM - карты, и так далее. Все они имеют свои преимущества, такие как простота использования, разрешение и необходимость специального оборудования, буфера или флуорофору.
Низкотемпературный Работоспособность
Для образцов изображений при низких температурах, два основных подхода были использованы, как на основе лазерной сканирующей конфокальной микроскопии архитектуры. Один из подходов заключается в использовании непрерывного потока криостат : только образец находится при низкой температуре и ее оптической адресацией через прозрачное окно. Другой возможный подход заключается в части оптики (особенно объективного микроскопа) в криогенном сосуде Дьюара для хранения . Этот второй подход, хотя и более громоздким, гарантирует лучшую механическую стабильность и позволяет избежать потерь из - за окна.
Изображений
Частичный профиль поверхности монеты 1-Евро, измеренная с помощью диска Нипкова конфокальной микроскопии.
Отражение данных для 1-монеты евро.
история
Начало: 1940-1957
Первый конфокальный сканирующий микроскоп был построен Marvin Минсков в 1955 и патент была подана в 1957 году сканирование точки освещения в фокальной плоскости была достигнута путем перемещения стадии. Ни одно научное издание представлено не было, и никакие изображения, сделанные с ним не были сохранены.
Тандем-сканирующий микроскоп
Схема Тандем-сканирующей микроскопии Petran в. Красный бар добавлен, чтобы указать Нипкова-диск.
В 1960 году чехословацкий Моймир Petran медицинский факультет Карлова университета в Пльзене разработала Тандем сканирующая микроскоп, первый Коммерциализированный конфокальной микроскопии. Он был продан небольшой компании в Чехословакии и в Соединенных Штатах Tracor-Северной (позже NORAN) и используется вращающийся диск Нипкова , чтобы генерировать множественные возбуждения и эмиссии микроотверстий.
Патент чехословацкий был подан в 1966 году по Petran и Милан Hadravský, чехословацкого коллеги. Первая научная публикация с данными и изображениями, полученных с этим микроскопом была опубликована в журнале Science в 1967 году, автором которого является М. Дэвид Эггер из Йельского университета и Petran. В примечании к этой статье упоминается, что Petran разработан микроскоп и руководил его строительством, и что он был, частично, «научный сотрудник» в Йельском университете. Второе издание с 1968 описал теорию и технические детали прибора и имел Hadravský и Роберт Галамбос , руководитель группы в Йельском университете, в качестве дополнительных авторов. В 1970 году был выдан патент США. Он был подан в 1967 году.
1969: Первый конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
В 1969 и 1971 годах, М. Дэвид Egger и Пол Davidovits из Йельского университета , опубликовал две статьи, описывающие первый конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Это была точка сканера, то есть только один освещение пятна был сгенерирован. Он используется эпи-освещение-отражение микроскопии для наблюдения нервной ткани. В 5 мВт гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм свет отражался от полупрозрачного зеркала в направлении цели. Цель была простой объектив с фокусным расстоянием 8,5 мм. В отличии от всех предыдущих и наиболее поздних систем, образец сканировали движением этой линзы (цель сканирования), что приводит к перемещению фокальной точки. Отраженный свет вернулся к полупрозрачный зеркалу, передаваемая часть была ориентирована другой линза на точечным обнаружение, за которой фотоэлектронный умножитель был помещен. Сигнал визуализировали с помощью ЭЛТ осциллографа, электронно - лучевой был перенесен одновременно с целью. Специальное устройство позволило сделать Polaroid фотографии , три из которых были показаны в 1971 публикации.
Авторы размышляют о флуоресцентных красителях для исследований в естественных условиях. Они ссылаются на патент Минского, спасибо Стив Бэра, в то время докторант в Альберта Эйнштейна школы медицины в Нью - Йорке , где он разработал конфокальной линии сканирующего микроскопа, предложившего использовать лазер с «микроскопом Мински» и поблагодарить Галамбос, Hadravsky и Petran для дискуссий, ведущих к развитию своего микроскопа. Мотивация для их развития было то, что в Tandem-сканирующей микроскопии только фракция 10 -7 освещающего света участвует в генерации изображения в части глаза. Таким образом, качество изображения не было достаточным для большинства биологических исследований.
1977-1985: Точечные сканеры с лазерами и сканирования сцены
В 1977 году Колин JR Sheppard и Tony Wilson описал конфокальной с эпи-лазера-подсветкой, сканирование стадии и фотоэлектронных умножителей как детекторы. Этап мог перемещаться вдоль оптической оси (Z-ось), что позволяет оптические серийные срезы.
В 1979 году Фред Brakenhoff и его коллеги показали, что теоретические преимущества оптического секционирования и улучшения разрешения действительно достижимо на практике. В 1985 году эта группа стала первой публиковать убедительные снимки, сделанные на конфокальной микроскопии, которые были в состоянии ответить на биологические вопросы. Вскоре после того, как много больше групп начали использовать конфокальной микроскопии, чтобы ответить на научные вопросы, которые до сих пор осталось загадкой из - за технологических ограничений.
В 1983 IJ Cox унд С. Шеппард из Оксфорда опубликовал первую работу в соответствии с которым конфокальный микроскоп, управляемый компьютером. Первый коммерческий лазерный сканирующий микроскоп, этап-сканер SOM-25 был предложен Oxford оптоэлектроники (после нескольких TAKE-кадром, приобретенных BioRad), начиная с 1982 г. Она была основана на конструкции группы Oxford.
Начиная с 1985: Лазерная точка сканеры с сканированием луча
В середине 1980-х годов, Уильям Брэдшоу Амоса и Джона Грэма Уайта и его коллег, работающих в лаборатории молекулярной биологии в Кембридже была построена первая конфокальной луча сканирующего микроскопа. Стадии с образцом не движется, вместо того, чтобы освещенность пятно, что позволяет быстрее получения изображений: четыре изображения в секунду с 512 строк каждая. Сильно преувеличены промежуточные изображения, из - за путем луча длиной 1-2 метров, допускается использование обычной ирисовой диафрагмы как «обскура», с диаметром ~ 1 мм. Первые микрофотографии были приняты при длительном воздействии на пленку, прежде чем был добавлен цифровой фотоаппарат. Дальнейшее усовершенствование позволило масштабирование в подготовку в первый раз. Цейсс примерно в то же время привели к коммерческому CLSM распространяемого шведской компании Зарастро~d. Предприятие было приобретено в 1990 году молекулярной динамики, но в конце концов CLSM прекращено. В Германии, Heidelberg Instruments , основанная в 1984 году, разработал КЛСМ, который был первоначально означало для промышленного применения, а не биологии. Этот документ был передан в 1990 году Leica Lasertechnik . Цейсс уже не-конфокальной летающего пятна лазерного сканирующего микроскопа на рынке, который был повышен до конфокальной. В докладе 1990 года, отметив, «некоторые» производитель confocals списков: Sarastro, технический инструмент, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-северного и Цейс.
В 1989 году Фриц Карл Preikschat , с сыном Ekhard Preikschat, изобрел сканирующий лазерный диод микроскоп для анализа размера частиц. Он и Ekhard Preikschat соучредителем Lasentec коммерциализировать. В 2001 году Lasentec был приобретен Mettler Toledo (NYSE: МПД). Около десяти тысяч систем были установлены по всему миру, в основном в фармацевтической промышленности для обеспечения контроля в месте процесса кристаллизации в больших системах очистки.
- Двухфотонное возбуждение микроскопия : Несмотря на то, что они используют соответствующую технологию (оба лазерные сканирующие микроскопы), многофотонные флуоресцентные микроскопы не являются строго конфокальными микроскопами. Термин конфокальной возникает из - за наличия диафрагмы в конъюгированной фокальной плоскости (конфокального). Эта диафрагма обычно отсутствует в многофотонных микроскопах.
- Полное внутреннее отражение флуоресцентный микроскоп (TIRF) о
конфокальной микроскопии- Виртуальный CLSM (Java-основе)
- анимация и разъяснение по различным типам микроскопов, включая флуоресцентные и конфокальные микроскопы . (Université Paris Sud)
Оптическая микроскопия также интенсивно развивается с использованием новейших достижений техники, информационных и компьютерных технологий. Это приводит к усовершенствованию имеющейся аппаратуры и методик ее применения, что обусловливает появление новых методов, в частности конфокальной микроскопии.
Конфокальный микроскоп отличается от «классического» оптического прибора тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценная картина строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Таким образом, в своеобразной форме реализуется принцип растровой электронной микроскопии, что позволяет сколь угодно долго регистрировать и обрабатывать сигнал с каждой отдельно взятой точки.
В обычном микроскопе в фотоприемное устройство свет попадает одновременно из различных точек образца. В конфокальном микроскопе, для того чтобы регистрировать свет только от одной точки, после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и регистрируется, а свет от остальных точек задерживается диафрагмой, как это показано на рис. 15.31.
Рис. 15.31
Еще одна особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в окрестностях анализируемой точки. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки не всегда обосновано. Альтернативой является применение светоделительной пластинки, гак чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.
Рассмотрим теперь математическую модель количественной оценки изменения контрастности при применении конфокальной микроскопии. Поскольку в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки представляет собой произведение независимых вероятностей того, что фотон попадет в точку с ее координатами, и что фотон, вышедший из этой точки, будет зарегистрирован.
В соответствии с критерием Рэлея для разрешения получается, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но несущественно. Для конфокального микроскопа имеем выражение для разрешения г
В то время как для обычного микроскопа
где А." = Х/п; п - коэффициент преломления; 0 - апертурный угол; D - диаметр апертуры; F- фокусное расстояние.
Основное достоинство конфокального микроскопа - не увеличение разрешения (в смысле критерия Рэлея), а существенное повышение контрастности. Тусклый объект с интенсивностью, к примеру, в 200 раз меньшей, чем у яркого, в обычный микроскоп не виден, хотя расстояние между объектами может быть намного больше того, что предписано критерием Рэлея. Напротив, конфокальный микроскоп такой объект должен зарегистрировать.
Важным параметром является размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, снижает отношение сиг- нал/шум и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.
Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы. Но размер диафрагмы, примерно в 3-5 раза больший пятна Эйри, представляется наиболее подходящим. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.
Развитием идеи конфокальной микроскопии явилась разработка конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ), что было вызвано потребностью в более чувствительных и метрологически строгих средствах анализа формы и пространственной структуры наблюдаемых объектов. Схема КЛСМ с основными функциональными связями показана на рис. 15.32.
Рис. 15.32. 1 - координатный столик; 2- исследуемый образец;
3,6 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 7, 9- игольчатые диафрагмы; 8- приемник излучения; 10 - лазер; 11 - блок управления; 12 - компьютер; 13 - привод для сканирования по оси Z
Особенность КЛСМ заключается в возможности послойного изображения исследуемого объекта с высоким разрешением и низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или с использованием столика со специальными флуоресцентными зондами, а также особыми методами ограничения световых потоков.
Разрешение КЛСМ определяется как оптической системой, так и электронным трактом обработки информации. Поэтому в конструкции КЛСМ, его схемах должны быть согласованы такие параметры, как разрешение оптической системы, шаг сканирования, характеристики детектора, а кроме того, выбраны оптимальные алгоритмы обработки и соответствующее программное обеспечение.
В общем случае глубина резкости КЛСМ зависит от апертуры, длины волны, когерентности источников света и размеров игольчатой диафрагмы. Игольчатая диафрагма (ИД) является основным элементом конструкции, отличающим КЛСМ от других типов микроскопов. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, которые не совпадают с фокальной плоскостью или находятся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости.
Выбор оптимального диаметра ИД важен для получения требуемых характеристик прибора. Соотношения для оценки латерального разрешения и глубины резкости КЛСМ получаются в предположении, что ИД имеет малое отверстие, являясь светящейся точкой. Реально размер ИД конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости.
При небольшом диаметре ИД световой поток становится малым, что уменьшает отношение сигнал/шум и снижает контрастность. При большом диаметре эффективность диафрагмы снижается за счет уменьшения апертуры.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии
Н.Н. ЛУКАШЕВА1 , С.Б. ТКАЧЕНКО1 , Н.Н. ПОТЕКАЕВ2 , Т.С. КУЗЬМИНА1 , Е.А. ВАСИЛЕВСКАЯ1
1 Лаборатория по изучению репаративных процессов в коже НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова; 2 кафедра
кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова
Lifetime-period reflecting confocal laser scan microscopy: the history of foundation, the principle of functioning, possibilities of using in dermatology
N.N. LUKASHEVA1 , S.B. TKACHENKO1 , N.N. POTEKAEV2 , T.S. KUZ’MINA1 , E.A. VASILEVSKAYA1
1 Laboratory by studying of reparative processes in the skin of Research Institute of molecular medicine of I.M. Sechenov Moscow medical academy; 2 FPPOP of I.M. Sechenov Moscow medical academy
Одной из тенденций современной медицины является применение неинвазивных органосохраняющих методов исследования. Благодаря научным разработкам и внедрению в практику инновационных технологий в последнее десятилетие появились новые неинвазивные высокоразрешающие методы исследования структуры кожи и других тканей. К ним относятся оптическая когерентная томография, высокочастотное ультразвуковое сканирование, ядерно-магнитный резонанс, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ). Последний метод занимает особое место среди визуализирующих технологий, так как позволяет получить изображение эпидермиса и поверхностной части дермы с разрешением, приближенным к традиционной световой микроскопии .
Основная концепция конфокальной микроскопии была разработана M. Minsky в середине 50-х годов прошлого столетия с целью исследования нейронной сети в нативном препарате ткани головного мозга без предварительного окрашивания . Это изобретение осталось без внимания в силу отсутствия на тот момент мощного источника света, необходимого для получения изображения, а также должного компьютерного оборудования для обработки полученной информации. Вслед за M. Minsky в 60-х годах M. Egger и M. Petran создали многолучевой конфокальный микроскоп с применением вращающегося диска для исследования неокрашенного препарата ткани головного мозга и клеток ганглиев . В 1973 г. благодаря работам M. Egger по дальнейшему совершенствованию конфокального лазерного сканирующего микроскопа впервые были
Klin Dermatol Venerol 2008;5:10-15
опубликованы различимые изображения клеток, полученные с помощью данного метода . Развитие компьютерных и лазерных технологий в 70-80-х годах прошлого столетия, а также возможность получения цифровых изображений привели к росту интереса к конфокальной микроскопии . И в 80-х годах несколько групп исследователей продемонстрировали использование тандемного сканирующего конфокального микроскопа для изображения тканей человека и животных in vivo . Вскоре после того как закончился патент M. Minsky, чертежи конфокального лазерного сканирующего микроскопа были использованы несколькими исследователями для создания рабочих аппаратов. Голландский физик G.F. Brakenhoff разработал конфокальный сканирующий микроскоп в 1979 г. , почти одновременно с ним C. Sheppard внес свой вклад в метод теорией создания изображения . T. Wilson, W. Amos и J. White разработали концепцию и позднее, в 80-х годах прошлого столетия, продемонстрировали полезность конфокальных изображений в исследовании флюоресцирующих биологических образцов . Первый коммерчески доступный аппарат появился в 1987 г. В 90-х годах достижения в оптике и электронике позволили создать более мощные и надежные лазеры, сканирующие зеркальные элементы с высоким коэффициентом полезного действия, высокопроизводительную волоконную оптику, более тонкий слой диэлектрического покрытия и детекторы, уменьшившие шумовые характеристики . Благодаря появившимся в конце 90-х годов высокоскоростным компьютерным системам, увеличенным мониторам и технологиям, позволяющим запоминать большой объем информации, наступил новый взрывной этап в развитии КЛСМ по количеству применений, на которые она могла быть
нацелена. Первые сообщения о применении конфокального лазерного сканирующего микроскопа для получения изображений кожи человека in vivo были опубликованы в 1995 г. . Отражательная конфокальная микроскопия, применяемая в дерматологии, была разработана М. Rajadhyaksha и соавт. и улучшена «Lucid Inc» . В 90-х годах группы исследователей (S. Gonzalez и соавт.) занимались изучением различных патологических состояний кожи с помощью отражательной конфокальной микроскопии и показали большую значимость данного метода как полезного диагностического инструмента .
В зависимости от применяемого источника света существуют разные виды конфокальной микроскопии. Конфокальная микроскопия может выполняться с использованием лазера в качестве источника света или без него. В тандемном сканирующем конфокальном микроскопе обычно используется ртутная лампа. По сравнению с тандемным сканирующим конфокальным микроскопом при КЛСМ используется лазерный луч определенной длины волны и высокой мощности освещения . Кроме того, различают флюоресцентную и отражательную КЛСМ. Благодаря своей безопасности и неинвазивности прижизненная отражательная КЛСМ является более предпочтительной в использовании .
Основной принцип отражательной КЛСМ основан на использовании точечного источника света (лазерный луч), освещающего маленькое пятно внутри ткани, с последующим улавливанием отраженного света через оптически соединенную апертуру (вкрапление) (рис. 1). Отраженный свет проходит через вкрапление, в результате чего только находящийся в фокусе свет достигает детектора, в то время как свет вне фокуса отклоняется. Таким образом, определяется единственный план внутри образца, который расположен в фокусе. Числовая апертура линзы объектива, длина волны и размер открытой апертуры (вкрапления) определяют разрешение изображения, получаемого с помощью отражательной КЛСМ. Лазеры различных длин волн могут быть использованы в качестве источника света для отражающей конфокальной микроскопии. Более длинные, близкие к инфракрасным, длины волн проникают глубже в кожу, но дают более низкое разрешение по сравнению с короткими длинами волн видимого спектра. Отражение света возникает в результате местных различий в коэффициенте преломления внутри ткани. Для отдельных органелл и структур оно обусловлено разницей в коэффициентах преломления по сравнению с ближайшим окружением. Меланосомы дают сильное отражение с длинами волн видимого (400-700 нм) и близкого инфракрасного (700-1064 нм) спектров из-за высокого индекса преломления по сравнению с окружающим эпидермисом. Поэтому клетки, содержащие
Рис. 1. Схема работы конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
меланин, такие как базальные кератиноциты и меланоциты, дают яркое изображение .
Существуют конфокальные сканирующие лазерные микроскопы различных фирм-произво- дителей: Vivascope 1000, 1500, 2500 Lucid Inc., Rochester, NY; Optiscan F900, Optiscan Pty. Ltd., Notting Hill, VIC, Australia и др. (рис. 2). При использовании конфокального лазерного микроскопа Vivascope 1500, Lucid Inc. лазерное сканирование осуществляется на длине волны 830 нм с оптической мощностью не более 16 мВт, которое не вызывает повреждения ткани или поражение глаза. Линза объектива дает 30-кратное увеличение (NA 0,9), при этом боковое разрешение составляет приблизительно 1 мкм и осевое разрешение (сечение толщины) 5 мкм. В микроскопе используется водная иммерсионная линза, так как коэффициент преломления воды близок к коэффициенту преломления эпидермиса , и это сводит к минимуму сферическую аберрацию, вызванную поверхностными эпидермальными слоями клеток, когда воспроизводится изображение глубже в дерме. Сканирование производится в плоскостях XY 4×4 мм с размером кадра 0,5×0,5 мм, частотой 9 кадров в секунду. С помощью этой системы можно получить изображение нормальной кожи на глубине от 200 до 400 мкм, достаточной для изображения эпидермиса и верхней части дермы (сосочковой и верхней ретикулярной). Отсканированное через иммерсионный объектив Lucid Stable View изображение с разрешением 1000×1000 точек обрабатывается программой
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Рис. 2. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп VivaScope 1500 «Lucid Inc».
Vivascope Ver.7,0 и передается на цветной монитор 19′′, имеющий максимальное разрешение 1280×1024 точек . При использовании микроскопа Vivascope 1500 не нужно применять контрастные вещества. Получение изображений возможно благодаря естественному контрасту и различиям в коэффициенте рефракции компонентов кожи, таких как меланин и кератин . Во время воспроизведения изображения используется специальное устройство для контакта с кожей, чтобы уменьшить образование артефактов. Оно содержит воду или гель на границе раздела фаз. Это устройство состоит из металлического кольца, которое фиксируется на коже пациента путем прилипания и соединяется с микроскопом, снабженным магнитом. Данное устройство имеет вогнутую форму, для того чтобы вмещать иммерсионную среду.
Метод КЛСМ позволяет получать изображения эпидермиса и поверхностной части дермы с разрешением, приближенным к традиционной световой микроскопии. С помощью данного метода можно получить изображения не только придатков кожи, но и отличить клетки различных слоев эпидермиса, волокна сосочкового слоя дермы, оценить состояние капилляров дермы. Можно исследовать морфологию разных клеток, определять размер, форму клеточных и субклеточных структур . Основное отличие КЛСМ от традиционного гистологического исследования заключается в том, что
получаемые изображения слоев кожи ориентированы горизонтально (параллельно) поверхности кожи (en face ), а также они представляют собой полутоновые изображения . В связи с этим могут возникать затруднения в трактовке полученных результатов и при сравнении изображений, полученных с помощью прижизненной КЛСМ и данными классической биопсии. С помощью КЛС микроскопа могут быть получены отдельные изображения сечений кожи, а также записаны небольшие кинофильмы для демонстрации динамических процессов, происходящих в коже, например кровотока .
Основными преимуществами прижизненной КЛСМ являются быстрота получения результата обследования по сравнению с классическим патогистологическим исследованием, которое включает в себя этапы иссечения маленького кусочка ткани (биопсию), фиксацию, нарезание на тонкие слои (сечения), окрашивание красителями и последующее изучение с помощью световой микроскопии. КЛСМ не изменяет ткани в ходе исследования, как это имеет место при гистологическом исследовании в результате получения сечений и их окрашивания, таким образом, минимизируется появление артефактов. Кроме того, процедура безболезненна, проходит без повреждения кожных покровов, не оставляет рубцовые изменения. Метод позволяет оценивать динамику заболеваний, а также дает возможность оперировать в режиме реального времени (при микрографической хирургии) .
Первые работы по применению КЛСМ в дерматологии были связаны с получением конфокальных изображений структуры здоровой кожи и последующим их анализом. В работах M. Rajadhyaksha, S. Gonzalez и соавт. , M. Huzaira и соавт. , K.J. Busam и соавт. приводятся подробные описания конфокальных изображений отдельных слоев эпидермиса, дермы, сосудистой сети, придатков кожи (отдельные сальные железы, сально-волосяные фолликулы, потовые протоки). Помимо качественных характеристик, даются морфометрическая оценка размеров клеток, глубины расположения и толщины слоев эпидермиса, оценка отдельных волокон и пучков коллагена сосочковой и верхней части ретикулярной дермы, приведены диаметр просветов капилляров, а также размеры отдельных клеток крови в просветах капилляров. K.J. Busam и соавт. , T.Yamashita и соавт. в своих статьях дают качественную оценку меланоцитам, приводят морфологические признаки меланоцитов, пигментированных кератиноцитов, меланофагов, позволя-
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
ющие различать указанные клетки на изображениях, полученных методом прижизненной КЛСМ. В ряде представленных работ дается оценка топографических особенностей строения здоровой кожи, проводится анализ возрастных изменений кожных покровов, влияния инсоляции на строение эпидермиса и дермы здоровых людей. Понимание того, как выглядят изображения здорового эпидермиса и дермы, имеет значение для последующего определения патологических изменений в коже.
Большое количество меланина, представленного в меланоцитарных очагах, делает пигментные новообразования кожи (невусы, меланома) идеальными для изображения и диагностики методом прижизненной КЛСМ . Целью любого визуализирующего метода, применяемого в дерматологии, является диагностика меланомы на ранних стадиях заболевания, так как от этого зависит эффективность проводимой терапии. Результаты исследований K.J. Busam и соавт. , G. Pellacani и соавт. , R. Langley и соавт. , A. Gerger и соавт. показали, что меланома может быть достаточно успешно диагностирована с помощью метода КЛСМ. Наличие плеоморфных ярких клеток внутри эпидермиса и дермы, которые могут быть звездообразной формы, обладать крупными ветвящимися отростками и эксцентрично расположенными крупными ядрами, а также нарушение архитектоники шиповатого слоя за счет нечетких границ клеток и ярких серых частиц (вероятно, меланина), распространенных внутри эпидермиса, позволяет диагностировать меланому . Внутриэпидермальная меланома также может быть диагностирована с помощью данного метода на основании критериев, которые применяются в традиционной гистологии. Конфокальные изображения внутриэпидермальных меланом позволили выявить увеличенное число интрадермальных увеличенных (атипичных) меланоцитов в солитарных единицах во всех слоях эпидермиса, включая верхние зернистый и шиповатый слои . Необходимо указать, что некоторые признаки меланом могут быть определены и в беспигментных меланомах . Однако следует отметить, что малые размеры выборок, на которых были проведены исследования, пока не позволяют судить о чувствительности и специфичности представленных критериев конфокальных изображений в постановке диагноза меланомы.
K.J. Busam и соавт., R. Langley и соавт. указывают на такие признаки меланоцитарных невусов на конфокальных изображениях, как наличие маленьких мономорфных круглых или овальных, сильно преломляющих свет клеток с центрально расположенными ядрами. Эти клетки могут быть видны внутри эпидермиса, в дермоэпидермальном соединении, типично окружая дермальный сосочек, и в поверхностной дерме в зависимости от вида невуса.
Они часто сгруппированы в круглые кластеры (гнезда), содержащие несколько клеток, расположенные вблизи кровеносных сосудов. Архитектура рогового, зернистого, шиповатого и базального слоев при этом остается неизмененной . Диспластические невусы характеризуются локальным уменьшением границ взаимодействия между кератиноцитами в дермоэпидермальном соединении, наличием характерных ярких гранул внутри эпидермиса (вероятно, меланиновых телец), большим разнообразием в размерах и форме невомеланоцитов, хотя они все еще имеют склонность быть более круглыми или овальными, чем ветвящимися. Приведенные исследования свидетельствуют о том, что признаки меланоцитарных невусов хорошо коррелируют с традиционной гистологической картиной. Однако остается до конца неизвестным, можно ли точно определить данным методом злокачественные клетки с малым количеством пигмента. Для выяснения этого вопроса необходимо проведение дальнейших исследований.
Метод прижизненной КЛСМ позволяет определять атипичные области, подозрительные в отношении неопластических очагов. В проанализированной литературе работы, посвященные изучению актинического кератоза, принадлежат D. Aghassi и соавт. , изучению плоскоклеточной карциномы - M. Horn и соавт. , исследованию базалиомы - M. Goldgrier и соавт. , A.L. Agero и соавт. , S. Nori и соавт. , K. Sauermann и соавт. . КЛСМ позволяет определять границы очага до начала терапии, что может быть полезным в оценке границ опухолей с радиальным характером роста, включая злокачественную лентиго-меланому, некоторые базалиомы или опухоли, трудные для клинического осмотра, например, склерозирующие инфильтративные базалиомы. Ключевые гистопатологические признаки актинического кератоза, выявляемые с помощью КЛСМ, включают архитектурный беспорядок, увеличение ядер эпидермиса с плеоморфизмом, паракератоз, что ведет к организованному беспорядку. В настоящее время глубина проникновения лазера является главным ограничением КЛСМ для диагностики актинического кератоза . Конфокальными признаками базалиомы - наиболее часто встречающейся опухоли кожи человека, являются островки мономорфных опухолевых клеток вытянутой формы с характерными вытянутыми ядрами, ориентированными вдоль той же самой оси. Эта картина однообразно ориентированных клеток проходит через всю толщу эпидермиса, теряя нормальную, напоминающую пчелиные соты модель, и архитектуру дермальных сосочков. Обильные кровеносные сосуды, демонстрирующие чрезмерную извилистость, также как и преимущественно мононуклеарный воспалительный инфильтрат, смешанны или тесно расположены с клетками базалиомы
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Результаты выполненного S. Nori и соавт. большого ретроспективного многоцентрового исследования показали значимую точность признаков, выявляемых при КЛСМ, для диагностики базалиомы in vivo . Таким образом, КЛСМ позволяет в реальном времени определить наличие резидуальной или клинически сомнительной базалиомы. По данным ряда исследований, КЛСМ помогает в скорой оценке границ опухолей при микрографической хирургии в ходе исследования эксцизионных образцов во время операции . Ограничивающими факторами в использовании прижизненной КЛСМ для диагностики опухолей кожи в настоящее время являются ограниченная глубина исследования, которая препятствует получению точных изображений ниже поверхностной дермы, и наличие преломляемости воспалительных клеток, среди прочих.
Выполненные в 90-х годах рядом исследователей (S. Gonzalez и др.) работы по изучению различных воспалительных состояний кожи с помощью отражательной конфокальной микроскопии позволили выявить большую значимость данного метода как полезного диагностического инструмента . Наибольшее преимущество метода заключается в том, что он позволяет в реальном времени оценивать динамические процессы при воспалительных заболеваниях кожи и, что очень важно, оценивать эффективность проводимой терапии дерматозов . С помощью прижизненной КЛСМ оценены воспалительные изменения при псориазе , аллергическом и простом контактном дерматитах , фолликулите , дерматомикозах , бородавках , простом герпесе , системном склерозе . На конфокальных изображениях признаки вульгарного псориаза в стационарной стадии соответствуют обычной гистологической картине и включают паракератоз, микроабсцессы Мунро, акантоз, расширение капилляров, папилломатоз . Отчетливо видны границы воспалительного очага . С помощью КЛСМ в режиме реального времени визуализируются такие типичные признаки контактного дерматита, как спонгиоз, образование микровезикул, воспалительный инфильтрат и местами эпидермальный некроз . С использованием данного метода были продемонстрированы патогистологические особенности простого и аллергического дерматитов, а также показано, что конфокальная микроскопия может применяться для оценки расовых (у представителей негроидной и европеоидной расы) особенностей острого контактного дерматита . Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия позволяет быстро, в реальном времени обнаруживать ветви гиф и воспалительный инфильтрат in vivo или iv vitro с ногтевых пластинок и кусочков кожи . Фолликулит, изображенный с помощью конфокальной микроскопии, может быть окончательно диагностиро-
ван путем прямой демонстрации внутриэпидермальных пустул, воспалительного инфильтрата, спонгиоза и дилатации капилляров . Бородавки на конфокальных снимках характеризуются гиперкератотическим роговым слоем и наличием множественных сильно преломляющих округлых структур размером 20-40 мкм внутри очага, что позволяет быстро и окончательно поставить диагноз . Герпетической инфекции кожи соответствуют плеоморфные баллонирующие кератиноциты и многоядерные гигантские клетки в свободной совокупности с кератиноцитами и воспалительными клетками .
Таким образом, метод прижизненной КЛСМ позволяет in vivo оценивать патоморфологические изменения в коже при различных дерматозах, включая неопластические очаги, меланоцитарные невусы, меланому, что, несомненно, подтверждает полезность данного инструмента в диагностике различных дерматологических заболеваний. Учитывая неинвазивный характер метода, возможность повторного многократного исследования одних и тех же очагов, представляется, что КЛСМ в большей степени полезна при оценке динамических изменений, происходящих в коже в ходе эволюции заболеваний и на фоне проводимой терапии дерматозов.
Несмотря на явные полезные стороны прижизненной КЛСМ, существуют также некоторые ограничения и сложности в применении данного метода. Настоящая техника сложна и затратна, и поэтому не очень широко доступна исследователям и клиницистам. Тем не менее несколько групп ученых в институтах и в промышленности разрабатывают более простые, менее затратные сканирующие технологии. Разрабатываются также более портативные аппараты по сравнению с ныне существующими, так как громоздкие установки неудобны в использовании при обследовании труднодоступных областей тела. Ограничивающим фактором в использовании прижизненной КЛСМ является ограниченная глубина исследования, которая препятствует получению точных изображений ниже поверхностной дермы. Продолжается работа по созданию вертикально ориентированных сечений, которые были бы сходны с теми, что мы видим при гистологическом исследовании, так как это значительно бы увеличило возможности прижизненной КЛСМ. Большую научную проблему составляет трактовка изображений
Способность читать, интерпретировать и анализировать конфокальные изображения с тем, чтобы выделить полезную клиническую и гистологическую информацию. Несколько групп ученых по всему миру выполняют детальные исследования, чтобы характеризовать конфокальные изображения и провести их корреляцию с гистологией. Одной из важных проблем остается определение чувствительности и специфичности данного метода исследования в диагностике разных дерматозов .
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
ЛИТЕРАТУРА
1. Abramovits W., Stevenson L.C. Changing paradigms in dermatology: new ways to examine the skin using noninvasive imaging methods. Clinics in Dermatology 2003; 21: 353-358.
2. Minsky M. Microscopy apparatus. US Pat 1961; 467.
3. Minsky M. Memoir on inventing the confocal scanning microscopy. Scanning 1988; 10: 128-138.
4. Egger M.D., Petran M. New reflected-light microscope for viewing unstained brain and ganglion cells. Science 1967; 157: 305-307.
5. Davidovits P., Egger M.D. Photomicrography of corneal endothelial cells in vivo. Nature 1973; 244: 366-367.
6. Amos W.B., White J.G. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell 2003; 95: 335-342.
7. Brakenhoff G.J., Blom P., Barends P. Confocal scanning light microscopy with high aperture immersion lenses. J Microscopy 1979; 117: 219- 232.
8. Sheppard C.J.R., Wilson T. Effect of spherical aberration on the imaging properties of scanning optical microscopes. Applied Optics 1979; 18: 1058.
9. Hamilton D.K., Wilson T. Scanning optical microscopy by objective lens. Scanning, Journal of Physics E: Scientific Instruments 1986; 19: 52-54.
10. Pawley J.B. Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press 1995.
11. Gonzalez S., Swindells K., Rajadhyaksha M., Torres A. Changing paradigms in dermatology: confocal microscopy in clinical and surgical dermatology. Clin Derm 2003; 21: 359-369.
12. Rajadhyaksha M., Grossman M., Esterowitz D. et al. In vivo confocal scanning laser microscopy of human skin: melanin provides strong contrast. J Invest Dermatol 1995; 104: 946-952.
13. Rajadhyaksha M., Gonzalez S., Zavislan J.M. Son R.R. et al. In vivo confocal scanning laser microscopy of human skin II: advances in instrumentation and comparison to histology. J Invest Dermatol 1999; 113: 101-112.
14. Confocal laser microscope images tissue in vivo. Laser Focus World 1997; 33: 119-127.
15. Rajadhyaksha M., Zavislan J.M. Confocal reflectance microscopy of unstained tissue in vivo. Retinoids 1998; 14: 26-30.
16. Gonzalez S., Rajadhyaksha M., Anderson R.R. Non-invasive (realtime) imaging of histologic margin of a proliferative skin lesion in vivo. J Invest Dermatol 1998; 111: 538-539.
17. Gonzalez S., Gonzalez E., White W.M. et al. Allergic contact dermatitis: correlation of in vivo confocal imaging to routine histology. J Am Acad Dermatol 1999; 40: 708-713.
18. Swindle L.D., Thomas S.G., Freeman M., Delaneyz P.M. View of normal human skin in vivo as observed using fluorescent fiber-optic confocal
microscopic imaging. J Invest Dermatol 2003; 121: 706- 712.
19. Delaney P.M., Harris M.R., King R.G. Novel microscopy using fiber optic confocal imaging and its suitability for subsurface blood vessel imaging in vivo. Clin Exp Pharmacol Physiol 1993; 197: 20.
20. Busam K.J., Charles C., Lohmann C.M. et al. Detection of intraepidermal malignant melanoma in vivo by confocal scanning laser microscopy. Melanoma Research 2002; 12: 349-355.
21. Aghassi D., Anderson R.R., González S. Confocal laser microscopic imaging of actinic keratoses in vivo: a preliminary report. J Am Acad Dermatol 2000; 43: 42-48.
22. Руководство по эксплуатации VivaScope 1500 Lucid Inc.
23. Corcuff P., Bertrand C., Leveque J.L. Morphometry of human epidermis in vivo by real-time confocal, microscopy. Arch Dermatol Res 1993; 285: 475-481.
24. Meyer L.E., Otberg N., Richter H., Sterry W. et al. New prospects in dermatology: fiber-based confocal scanning laser microscopy. Laser Physics 2006; 16: 5: 758-764.
25. Serup J., Jemec G.B.E., Grove G.L. Handbook of non-invasive methods and the skin. 2nd ed. CRC Press 2006; 32: 267-276.
26. Huzaira M., Rius F., Rajadhyaksha M., Anderson R.R. et al. Topographic variations in normal skin, as viewed by in vivo reflectance confocal microscopy. J Invest Dermatol 2001; 116: 846-852.
27. Busam K.J., Charles C., Lee G., Halpern A.C. Morphologic features of melanocytes, pigmented keratinocytes and melanophages by in vivo
confocal scanning laser microscopy. Mod Pathol 2001; 14: 9: 862- 868.
28. Yamashita T., Kuwahara T., Gonzalez S., Takahashi M. Non-invasive visualization of melanin and melanocytes by reflectance-mode confocal microscopy. J Invest Dermatol 2005; 124: 235-240.
29. Sauermann K., Clemann S., Jaspers S., Gambichler T. et al. Age related changes of human skin investigated with histometric measurements by confocal laser scanning microscopy in vivo. Skin Research and Technology 2002; 8: 52-56.
30. Sauermann K., Jaspers S., Koop U., Wenck H. Topically applied vitamin C increases the density of dermal papillae in aged human skin. BMC Dermatology 2004; 4:13 doi:10.1186/1471-5945-4-13.
31. Pellacani G., Cesinaro A.M., Seidenari S. Reflectance-mode confocal microscopy of pigmented skin lesions-improvement in melanoma diagnostic specificity. J Am Acad Dermatol 2005; 53: 979-985.
32. Langley R.G.B., Rajadhyaksha M., Dwyer P.J., Sober A.J. et al. Confocal scanning laser microscopy of benign and malignant melanocytic skin lesions in vivo. J Am Acad Dermatol 2001; 45: 365-376.
33. Gerger A., Koller S., Kern T., Massone C. et al. Diagnostic applicability of in vivo confocal laser scanning microscopy in melanocytic skin tumors. J Invest Dermatol 2005; 124: 493-498.
34. Busam K.J., Hester K., Charles C. et al. Detection of clinically amelanotic malignant melanoma and assessment of its margins by in vivo confocal scanning laser microscopy. Arch Dermatol 2001; 137: 923-929.
35. Horn M., Gerger A., Koller S. et al. The use of confocal laser-scanning microscopy in microsurgery for invasive squamous cell carcinoma. British Journal of Dermatology 2007; 156: 81-84.
36. Goldgrier M., Fox C.A., Zavislan J.M. et al. Noninvasive imaging, treatment and microscopic confirmation of clearance of basal cell carcinoma. Dermatol Surg 2003; 29: 205-210.
37. Agero A.L.C., Busam K.J., Benvenuto-Andrade C. Reflectance confocal microscopy of pigmented basal cell carcinoma. J Am Acad Dermatol 2006; 54: 638-643.
38. Nori S., Rius-Dıaz F., Cuevas J. et al. Sensitivity and specificity of reflectance-mode confocal microscopy for in vivo diagnosis of basal cell сarcinoma: a multicenter study. J Am Acad Dermatol 2004; 51: 923-930.
39. Sauermann K., Gambichler T., Wilmert M. et al. Investigation of basal cell сarcinoma by confocal laser scanning microscopy in vivo. Skin Research and Technology 2002; 8: 141-147.
40. Gonzalez S., Sackstein R., Anderson R.R., Rajadhyaksha M. Real-time evidence of in vivo leukocyte trafficking in human skin by reflectance confocal microscopy. J Invest Dermatol 2001; 117: 2: 384-386.
41. González S., Rajadhyaksha M., Rubinstein G., Anderson R.R.
Characterization of psoriasis in vivo by reflectance confocal microscopy. J Med 1999; 30: 337-356.
42. Astner S., Gonzalez E., Cheung A.C. et al. Non-invasive evaluation of the kinetics of allergic and irritant contact dermatitis. J Invest Dermatol 2005; 124: 351-359.
43. Hicks S.P., Swindells K.J., Middelkamp-Hup M.A. et al. Confocal histopathology of irritant contact dermatitis in vivo and the impact of skin color (black vs white). J Am Acad Dermatol 2003; 48: 727-734.
44. Gonzalez S., Rajadhyaksha M., Gonzalez-Serva A. et al. Confocal reflectance imaging of folliculitis in vivo: correlation with routine histology. J Cutan Pathol 1999; 26: 201-205.
45. Markus R., Huzaira M., Anderson R.R., Gonzalez S. A better potassium hydroxide preparation? In vivo diagnosis of tinea with confocal microscopy. Arch Dermatol 2001; 137: 1076-1078.
46. Hongcharu W., Dwyer P., Gonzalez S., Anderson R.R. Confirmation of onychomycosis by in vivo confocal microscopy. J Am Acad Dermatol 2000; 42: 214-216.
47. Goldgeier M., Fox C.A., Muhlbauer J.E. Immediate noninvasive diagnosis of herpesvirus by confocal scanning laser microscopy. J Am Acad Dermatol 2002; 46: 783-785.
48. Sauermann K., Gambichler T., Jaspers S. et al. Histometric data obtained by in vivo confocal laser scanning microscopy in patients with systemic sclerosis. BMC Dermatology 2002; 2: 8.
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 5, 2008 |
Конфокальная микроскопия — один из методов оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом по сравнению с микроскопами классической схемы за счет использования диафрагмы, отсекающей поток фонового рассеяного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек в основном задерживается диафрагмой.
Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.
Уменьшение отверстия в диафрагме приводит к уменьшению толщины оптического слоя, что повышает контрастность изображения, однако при этом падает его яркость, что требует использования высокочувствительных регистрирующих систем и в процессе исследования заставляет идти на компромисс между яркостью и контрастом получаемого изображения.
Наиболее часто встречающейся задачей для конфокальной микроскопии, благодаря ее высокому разрешению и контрасту, является изучение структуры клеток и их органелл, например, цитоскелета, ЭПР, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов. Исследуется также колокализация в клетке двух и более веществ. Еще одна задача - исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках. Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.
Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление флуоресценции после фотовыжигания) и FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer (Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса).
Глоссарий:
FRAP применяется для исследования подвижности биоорганических молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения и последующего его рассоединения с молекулами. После выжигания молекулы с флуорохромом из необлученной зоны движутся вследствие диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о подвижности молекул.
FRET применяется для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия. Молекулы метятся двумя флуорохромами со спектром испускания донора, перекрывающимся со спектром поглощения акцептора. Энергия от донора к акцептору передается на малых расстояниях (несколько нм) в результате резонанса между энергетическими уровнями, а его вероятность зависит от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным микроскопом.
Двухфотонная (мультифотонная) микроскопия - Two Photon (Multiphoton) Microscopy - Методика, производная от лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, при которой возбуждение флуорохромов осуществляется лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, плотность которого удваивается или даже утраивается в месте фокусировки на образце. Флуорофоры образца переводятся в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Например, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм. Мультифотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в толщу тканей и не требует наличия конфокальной микродиафрагмы, так как ее флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости.
Акусто-оптический перестраиваемый фильтр (AOTF) - Acousto- Optic Tunable Filter (AOTF) - Фильтрующее устройство, использующее звуковые колебания для модулирования длины волны или интенсивности света, испускаемого лазером или некогерентным источником света (в первую очередь дуговыми лампами). Фильтр состоит из специализированного кристалла (оксид теллура или кварц), зажатого с двух сторон акустическими излучателем и поглотителем для наведения в кристалле стоячих акустических волн с переменными зонами высокого и низкого преломления. Если поляризованный или неполяризованный свет проходит через фильтр, кристалл воздействует на него как дифракционная решетка, отклоняющая проходящий луч. Для изменения периода дифракционной решетки выбираются характерные длины стоячих волн, получаемые в результате изменения звуковых колебаний, подводимых к кристаллу.
Полосовой фильтр - Bandpass Filter - фильтр, пропускающий определенный диапазон (полосу) длин волн ослабляя при этом волны большей и меньшей длины, чем у пропускаемых. Длина волны в середине пропускаемой полосы обычно называется средней (английская аббревиатура CWL). Эффективная полоса пропускания измеряется шириной зоны, пропускающей половину от максимума падающего света, которая еще называется полосой половинного пропускания (аббревиатуры FWHM и HBW). В флуоресцентной микроскопии полосовые фильтры чаще используются в тракте возбуждения и реже в качестве пороговых (барьерных) фильтров.
Светоделитель - Beamsplitter - Оптическое устройство, используемое для разделения падающего светового луча на две или более составляющих, каждые из которых проецируются в различных направлениях. Для выполнения каких-либо определенных условий светоделители бывают различных конфигураций. В окулярных блоках оптических микроскопов используются призматические светоделители для одновременного проецирования изображения в окуляры и фотокамеру (цифровую камеру). Для получения линейно поляризованного света применяются поляризующие светоделители из природного кварца - материала с двойным преломлением. В флуоресцентной микроскопии для отражение волн возбуждения обратно к источнику и пропускания более длинноволнового вторичного флуоресцентного излучения к окулярам и детектору в качестве светоделителей используются дихроматичные (дихроичные) зеркала.
Холодное зеркало - Cold Mirror - Специализированный дихроматичный интерференционный фильтр, который в очень широком диапазоне температур отражает весь видимый спектр, но очень эффективно пропускает волны в инфракрасной области. Аналогично горячим зеркалам холодные могут быть разработаны для отражения лучей, падающих под углами от нуля до 45 градусов и представлять собой многослойные диэлектрические покрытия наподобие интерференционных фильтров. Холодные зеркала могут использоваться в качестве дихроматических светоделителей в лазерных системах для отражения видимого света и пропускания инфракрасного.
Дихроматичный светоделитель (дихроичное зеркало) - Dichromatic Beamsplitter (Dichroic Mirror) - Комбинация интерференционных фильтров/зеркал обычно применяемая в наборах фильтров для флуоресцентной микроскопии для получения четко определяемого перехода между пропускаемыми и отраженными длинами волн. Дихроматичное зеркало, наклоненное под углом 45 градусов к падающему свету и испускаемому излучению, отражает коротковолновое излучение возбуждения под углом 90 градусов на образец и пропускает более длинноволновое излучение от образца на окуляры и детектор. Дихроматичные зеркала для флуоресцентной микроскопии, изготовленные с использованием тонких интерференционных пленок способны отразить до 90 % возбуждающего излучения, одновременно пропуская до 90 % полосы флуоресцентного излучения. Дихроматичные зеркала обычно являются центральным (основным) элементом в трех видах фильтров (возбуждения, барьерных и дихроматичных зеркал), находящихся в составе блока флуоресцентных оптических фильтров.
Скат фильтра - Filter Slope - Скат оптического фильтра - это характеристика профиля фильтра в области перехода от запирания к пропусканию. В целом, скат фильтра характеризуется длиной волны, на которой фильтр демонстрирует определенный коэффициент пропускания и крутизну характеристики в этом месте. Два различных фильтра могут иметь одни и те же частоты среза, но совершенно разные уровни запирания и скаты. Фильтры с очень крутыми скатами имеют узкую полосу пропускания, в то время как пологие скаты означают широкую полосу.
Полная ширина на половине максимума - Full Width at Half Maximum (FWHM) - Диапазон длин волн пропускаемых стеклянным или интерференционным фильтром описывается параметром, известным как полная ширина на половине максимума (FWHM). Границы среза определяются как наименьшая и наибольшая длины волн, пропускаемые фильтром на уровне 50% от максимума, а средняя длина волны (CWL или СДВ) представляет собой среднее арифметическое от всех длин волн внутри диапазона. Например, величина FWHM, равная 40 означает, что ширина пропускаемого диапазона волн составляет 40 нм, причем значение СДВ (CWL) может лежать где угодно от ультрафиолетовой до инфракрасной частей спектра. Во многих текстах FWHM может обозначаться как половинная полоса пропускания (half bandwidth, HBW).
Видеокамеры ISIT - Intensifier Silicon- Intensifier Target (ISIT) Camera - Видеокамеры, предназначенные для работы при низком уровне освещения, как например в флуоресцентной микроскопии образцов с очень низким квантовым выходом. Эти камеры как правило включают в себя SIT - трубку (с диодной матрицей) дополненную усилителем изображения в комбинации с волоконной оптикой на первой ступени усиления света.
Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия (БСОМ ) - Near- Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) - Ближнепольное изображение получается при размещении оптического зонда (световода) субмикронного размера на чрезвычайно близком расстоянии от изучаемого объекта, а свет пропускается через небольшую диафрагму на конце зонда. Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. В пределах ближнего поля затухающий свет не ограничен дифракцией, и возможно получение информации относительно объектов нанометрового порядка. Это явление позволяет получать изображения за пределами дифракционного барьера и проводить спектроскопию образцов, недостижимую средствами обычной оптической микроскопии.